Na slici Madona sa češljugarom, kao i na većini Madona iz njegovog firentinskog perioda, Rafael Santi je rasporedio tri figure Madonu i dva mala naga dečaka, Isusa Hrista i Jovana Krstitelja u grubi oblik piramide koji podseća na modele koje je koristio Leonardo da Vinči. Tri figure su naslikane u brdovitom pejzažu sa travnjakom u prvom planu koji je prošaran cvećem i biljkama nalik na peršun, rekom koja protiče i drvećem u pozadini između planinskih vhova. Iako je prirodno okruženje raznoliko, sve mirno uokviruje centralni događaj koji se odvija. Madona je predstavljena kao mlada i lepa žena sa blaženim osmehom, u tradicionalnoj crvenoj haljini, simbolu strasti i plavom ogrtaču, simbolu Crkve. Ona sedi na steni i okreće pogled prema dečacima u kratkoj pauzi od čitanja knjige sa prikazom gorkog proročanstva o sudbini njenog sina koju drži u levoj ruci. Ispred nje, između nogu je Isus, koji oslonjen na njeno stopalo kao da traži zaštitu. Na levoj strani je Jovan sa ogrtačem vezanim oko pojasa. On drži češljugara koji simbolizuje Isusovo stradanje, a Isus pruža ruku da ga dodirne.